Long Taq DNA Polymerase
長(zhǎng)片段DNA聚合酶
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目錄號(hào)
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濃度
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包裝
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RTL3102-02
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5 U/μl
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500 U （100μl）
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RTL3102-03
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5 U/μl
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5×500 U（5×100μl）
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● 貯存
-20℃保存一年。
● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介
Long Taq DNA Polymerase是由pfu DNA Polymerase和Taq DNA聚合酶按照一定的比例混合而成。兩種酶協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)了擴(kuò)增效率、合成速度和延伸性能的完美統(tǒng)一，在長(zhǎng)片段PCR反應(yīng)中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，可以合成超長(zhǎng)的DNA片段。另外，此酶具有比Taq DNA聚合酶約5倍的PCR可信度。該酶的大多數(shù)PCR產(chǎn)物3’端帶堿基A，可以通過(guò)TA克隆法進(jìn)行克隆。
● 產(chǎn)品組成（RTL3102-02）
Long Taq DNA Polymerase（5U/μl） 100μl
10×Long Taq PCR buffer（含Mg2＋） 1ml
2×GC buffer 2×1 ml
產(chǎn)品組成（RTL3102-03）
Long Taq DNA Polymerase（5U/μl） 5×100μl
10×Long Taq PCR buffer（含Mg2＋） 5×1ml
2×GC buffer 10×1 ml
● 活性定義
1單位(U) Taq DNA Polymerase活力定義為在74℃、30分鐘內(nèi)，以活性化的大馬哈魚(yú)精子DNA作為模板/引物，將10 nmol脫氧核苷酸摻入到酸不溶物質(zhì)所需的酶量。
● 酶貯存緩沖液
50 mM Tris-HCl (pH 8.0);0.1 mMEDTA;1 mMDTT;50 mMKCl ; Stabilizers; 50% glycerol
● 適用范圍
短鏈和長(zhǎng)鏈DNA擴(kuò)增，特別適合于長(zhǎng)片段DNA的擴(kuò)增。
● 使用說(shuō)明：
1. 按照下表在0.2ml PCR管中制備反應(yīng)體系：
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成分
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體積
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終濃度
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Template
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0.1-1μg
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as you wish
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Primer 1（10 μM）
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1μl
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200nM
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Primer 2（10 μM）
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1μl
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200nM
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10×Long Taq PCR buffer
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5μl
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1×
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dNTP Mixture(10 mM)
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1μl
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200μM each
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Long Taq (5 U/μl)
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0.5-1μl
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2.5-5U
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ddH2O
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up to 50μl
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-
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2. 混勻后，離心快甩將反應(yīng)液收集到管底。
3. PCR儀如果沒(méi)有熱蓋加熱的話，補(bǔ)加25μl礦物油。
4. PCR儀上執(zhí)行以下程序：
三步法：
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步驟
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溫度
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時(shí)間
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循環(huán)數(shù)
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初始變性
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94℃
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1-5 min
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1
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變性
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94℃
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30 sec
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25-40*
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退火
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Tm-5℃*
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30 sec
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延伸
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72℃
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1 min/kb
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最后延伸
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72℃
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5 min
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1
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兩步法：
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步驟
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溫度
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時(shí)間
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循環(huán)數(shù)
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初始變性
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94℃
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1-5 min
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1
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變性
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94℃
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30 sec
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25-40*
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退火和延伸
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68℃
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1 min/kb
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最后延伸
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72℃
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5 min
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1
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*注： PCR 反應(yīng)條件視模板、引物等的結(jié)構(gòu)條件不同而各異。在實(shí)際操作中需根據(jù)模板、目的片段的大小、堿基序列和引物的長(zhǎng)短等具體情況，設(shè)定最佳的反應(yīng)條件（溫度、時(shí)間等）。
● 使用舉例：
● 常見(jiàn)問(wèn)題：
Q1： Long Taq DNA polymerase能擴(kuò)增多長(zhǎng)片段？
A1：對(duì)簡(jiǎn)單模板（如λ噬菌體做模板），可以擴(kuò)增20kb片段；對(duì)復(fù)雜模板（如基因組DNA），可以擴(kuò)增8kb片段。
Q2：Long Taq DNA polymerase保真性怎樣？
A2：Long Taq含有3’-5’校對(duì)活性的聚合酶，有校對(duì)功能。保真性為普通Taq酶的5倍。
Q3： Long Taq DNA polymerase是否只能擴(kuò)增長(zhǎng)片段？
A3：Long Taq也能很好的擴(kuò)增低于5kb的片段，只是在長(zhǎng)片段擴(kuò)增中更有優(yōu)勢(shì)。
Q4：進(jìn)行長(zhǎng)片段PCR時(shí)，為什么推薦使用2階段溫度PCR法？
A4：長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增時(shí)要設(shè)計(jì)比較長(zhǎng)的引物，以增加引物的特異性，而長(zhǎng)引物的Tm比較高。在進(jìn)行長(zhǎng)片段PCR時(shí)，退火溫度和延伸溫度間的差距很小，當(dāng)退火溫度超過(guò)60℃時(shí)，退火溫度和延伸溫度可以設(shè)定為一個(gè)溫度，一般為68℃，這樣進(jìn)行2階段溫度PCR，在長(zhǎng)片段PCR中能得到更好的效果。
Q5：使用Long Taq DNA polymerase的擴(kuò)增產(chǎn)物是否可以進(jìn)行TA克??？
A5：由于使用Long Taq得到的PCR產(chǎn)物大多數(shù)帶有A，可以進(jìn)行TA克隆。然而，如果想提高TA克隆的連接效率，建議加A后再進(jìn)行TA克隆。
Q6：Long Taq DNA polymerase可以擴(kuò)增高GC含量片段嗎？
A6：要擴(kuò)增高GC含量片段，建議使用Long Taq配合2×GC buffer使用；不建議使用10×Long Taq buffer。