RealPAGE plus彩色凝膠快速制備試劑盒
RealPAGE plus Colour Gel Fast Preparation Kit
● 貨品規(guī)格：
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貨號(hào)
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說(shuō)明
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制膠數(shù)量
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RTD6132-06
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制備6%PAGE膠
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125塊 0.75mm膠
＞90塊1 mm膠
＞60塊1.5 mm膠
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RTD6132-08
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制備8%PAGE膠
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RTD6132-10
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制備10%PAGE膠
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RTD6132-12
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制備12%PAGE膠
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RTD6132-15
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制備15%PAGE膠
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● 貨品內(nèi)容：
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組份
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貨號(hào)
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名稱
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規(guī)格
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保存
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1
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RTD6132-UA
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上層膠溶液A
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80 ml
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4℃
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2
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RTD6132-UB
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彩色上層膠溶液B
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80 ml
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4℃
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3
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RTD6132-LA06
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下層膠溶液A 6%
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250 ml
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4℃
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RTD6132-LA08
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下層膠溶液A 8%
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250 ml
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4℃
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RTD6132-LA10
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下層膠溶液A 10%
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250 ml
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4℃
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RTD6132-LA12
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下層膠溶液A 12%
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250 ml
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4℃
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RTD6132-LA15
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下層膠溶液A 15%
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250 ml
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4℃
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4
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RTD6132-LB
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下層膠溶液B
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250 ml
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4℃
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5
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RTD6132-SP
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改良型促凝劑
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8 ml
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4℃，配制后-20℃貯存
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說(shuō)明書
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一份
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● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
該產(chǎn)品利用聚丙烯酰胺凝膠電泳原理，采用合理設(shè)計(jì)的預(yù)混合配方和配制流程，可在50分鐘內(nèi)配制得到高質(zhì)量的聚丙烯酰胺凝膠，用于變性和非變性蛋白凝膠電泳。本產(chǎn)品可以配制常用分離膠濃度6%、8%、10%、12%和15%，可以滿足絕大多數(shù)蛋白電泳需求。
本試劑盒大約可以配制60-125塊常規(guī)大?。?×10cm）PAGE凝膠，具體數(shù)量根據(jù)凝膠厚度決定：0.75mm厚度凝膠可以配制125塊膠，1mm厚度凝膠可以配制至少90塊膠，1.5mm厚度凝膠可以配制至少60塊膠。
● 運(yùn)輸和貯存：
本產(chǎn)品常溫運(yùn)輸；組份按照標(biāo)簽溫度貯存；有效期一年。
● 特點(diǎn)：
1. 方便：彩色上層膠，方便上樣；上層膠和下層膠溶液1:1混合，無(wú)需計(jì)算；
2. 安全：不用接觸有毒粉末；不用單獨(dú)添加TEMED；
3. 兼容性廣：制膠溶液中不含SDS，可用于非變性電泳（Native-PAGE）；
● 使用說(shuō)明：
一 凝膠制備：
1.1參照凝膠模具說(shuō)明書，裝配好凝膠模具。
1.2 根據(jù)下表參考選擇合適的凝膠濃度
表一不同濃度的PAGE下層膠的最佳分離范圍
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下層膠（分離膠）濃度
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最佳分離范圍
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6%
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50-350 kD
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8%
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35-300 kD
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10%
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20-150 kD
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12%
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15-100 kD
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15%
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10-80 kD
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1.3 根據(jù)下表配制凝膠：
表二 凝膠配制表
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下層膠配方
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上層膠配方
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膠厚度
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下層膠溶液B
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下層膠溶液A
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改良型促凝劑
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膠厚度
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彩色上層膠溶液B
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上層膠溶液A
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改良型促凝劑
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0.75 mm
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2 ml
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2 ml
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40 μl
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0.75 mm
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0.5 ml
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0.5 ml
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10 μl
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1.0 mm
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2.5 ml
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2.5 ml
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50 μl
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1.0 mm
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0.75 ml
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0.75 ml
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15 μl
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1.5 mm
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4 ml
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4 ml
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80 μl
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1.5 mm
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1 ml
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1 ml
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20 μl
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1.3.1 取等體積下層膠溶液B 和下層膠溶液A ，各 2.0/2.5/4.0 ml，混勻；
1.3.2混合溶液中加入 40/50/80 μl的改良型促凝劑，輕輕混勻，將混勻后的溶液注入制膠玻璃板中，使液面和短玻璃板上沿之間的距離比梳齒長(zhǎng)0.5 cm即可；
注意：此溶液為過(guò)量，請(qǐng)勿全部注入。
1.3.3 沿玻璃板緩慢加入適量滅菌水或無(wú)水乙醇覆蓋于下層膠之上，待下層膠凝固后，倒去上層水或乙醇；
注意：當(dāng)水（乙醇）和膠之間有一條折射線時(shí)，說(shuō)明膠已凝固；25℃時(shí)5-10分鐘可以聚合。
1.3.4 取等體積彩色上層膠溶液B和上層膠溶液A ，各 0.5/0.75/1.0 ml，混勻；
1.3.5向混合溶液中加入 10/15/20 μl 的改良型促凝劑，輕輕混勻，插入梳齒；
1.3.6 待上層膠凝固后 （約20-40 min），拔去梳齒即可用于電泳。
注：凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí)，聚合較快；冬天氣溫低時(shí)，聚合時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)。
上層膠25℃ 20-25分鐘可以聚合；18℃ 35-40分鐘可以聚合。
二 電泳：
2.1 SDS-PAGE變性電泳：
2.1.1電泳緩沖液配制：
將5×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液干粉（自備，組份0.96 M 甘氨酸，0.125 M Tris，0.5% SDS）全部倒入1L燒杯中，加入約900 ml水徹底溶解，用水定容至1 L，即配成5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液（此溶液不用調(diào)節(jié)pH值）。用前再稀釋5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液。
2.1.2 樣品處理：融化-混合-變性-上樣
5×MonoColor蛋白上樣緩沖液常溫?cái)?shù)分鐘解凍后輕輕搖勻，以確保溶液混合均勻；將緩沖液與蛋白樣品按照1：4的比例混勻，如8 μl樣品加入2 μl 5×上樣緩沖液；將蛋白樣品置于95℃中加熱5-10分鐘；蛋白樣品加入凝膠加樣孔內(nèi)電泳。
2.1.3 電泳過(guò)程；
在電泳槽的內(nèi)槽內(nèi)加入1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液(讓電泳緩沖液漫過(guò)加樣孔)，輕輕的撥出梳子，用1ml吸頭徹底沖洗加樣孔，隨后在電泳槽外槽加入適量的1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液。
表三 SDS-PAGE電泳條件
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恒電壓
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起始電流（一板膠）
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結(jié)束電流（一板膠）
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電泳時(shí)間
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適用條件
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150V
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35-40 mA
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15-20 mA
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55 + min
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最佳電壓，最優(yōu)的分辨率
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200V
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45-55 mA
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20-25 mA
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45+ min
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節(jié)省時(shí)間
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225V
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40-50 mA
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15-20 mA
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35+ min
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250V
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65-75 mA
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20-25 mA
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30+ min
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300V
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70-80 mA
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25-35mA
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25+ min
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最省時(shí)間
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2.2 非變性電泳（Native PAGE）：
2.2.1電泳緩沖液配制：
將5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液干粉（自備，組份0.96 M 甘氨酸，0.125 M Tris）全部倒入1L燒杯中，加入約900 ml水徹底溶解，用水定容至1 L，即配成5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液（此溶液不用調(diào)節(jié)pH值）。用前再稀釋5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液。
2.2.2 樣品處理：融化-混合-上樣
5×非變性非還原蛋白上樣緩沖液常溫?cái)?shù)分鐘解凍后輕輕搖勻，以確保溶液混合均勻；將緩沖液與蛋白樣品按照1：4的比例混勻，如8 μl樣品加入2 μl 5×上樣緩沖液；蛋白樣品加入凝膠加樣孔內(nèi)電泳。注：非變性電泳樣品不能加熱處理。
2.2.3 電泳過(guò)程；
在電泳槽的內(nèi)槽內(nèi)加入1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液(讓電泳緩沖液漫過(guò)加樣孔)，輕輕的撥出梳子，用1ml吸頭徹底沖洗加樣孔，隨后在電泳槽外槽加入適量的1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液。
表四 Native PAGE電泳條件
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恒電壓
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起始電流
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結(jié)束電流
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電泳時(shí)間
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適用條件
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推薦電壓
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150V
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25-35/板膠
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5-10 mA/板膠
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60 + min
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最佳電壓，最優(yōu)的分辨率
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三. 染色：
1. 將電泳后的PAGE膠取下放入塑料容器中，加入適量FastBlue蛋白染色液或常規(guī)考馬斯亮藍(lán)染色液（以剛剛覆蓋過(guò)膠面為適），條帶1-2分鐘即可見。
2. 搖床常溫?fù)u動(dòng)10-15分鐘至條帶清晰可見。
3. 加入適量蒸餾水脫色，期間更換1-2次蒸餾水，搖床常溫?fù)u動(dòng)10-15分鐘至背景干凈。
4. 觀察保存結(jié)果。
四. 實(shí)驗(yàn)示例：
