RealPAGE 3-8% Tris-醋酸預制膠
● 產(chǎn)品組成：
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貨號
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名稱
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規(guī)格
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貯存
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RTD6154-0308
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RealPAGE
3-8% Tris-醋酸預制膠
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10板/盒
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4-8℃
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說明書
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一份
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-
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● 產(chǎn)品簡介：
Tris-醋酸-SDS-PAGE凝膠電泳適合于分離高分子量蛋白，可以有效分離50-500 kD范圍內(nèi)蛋白；電泳體系呈中性，抑制半胱氨酸的二次氧化，防止二硫鍵在凝膠中交聯(lián)；在變性還原電泳中，電泳緩沖體系中加入抗氧化劑，整個電泳過程都在還原條件下進行，有效防止二硫鍵的形成。
RealPAGE 3-8% Tris-醋酸預制膠為梯度凝膠，濃度為3-8%，厚度為1.1 mm，12齒，每個泳道可以上樣最大30 μl樣品。另外，本公司也提供Tris-醋酸-SDS-PAGE電泳試劑盒（貨號：RTD6155）包含預制膠、蛋白上樣、蛋白電泳、染色及轉膜所需的全部試劑。
● 貯存及運輸：
按照標簽溫度貯存；試劑盒常溫運輸。
● 使用說明：
1. 實驗準備：
1.1 20×樣品還原劑為干粉，4℃貯存。用前加入1ml超純水震蕩徹底溶解后使用，已經(jīng)溶解的20×樣品還原劑-20℃貯存。
1.2 400×抗氧化劑為干粉，常溫貯存。用前加入15 ml超純水震蕩徹底溶解后使用，已經(jīng)溶解的400×抗氧化劑-20℃貯存。
2. 電泳：
注：伯樂Mini III或Mini-PROTEAN Tetra Cell，天能VE-180，六一24K系列電泳槽請確保密封條的安裝方向（如圖）。
六一其他系列，君意東方JY-SCZ2/4，百晶BG-verMINI等電泳槽可以直接使用預制膠。
不兼容Thermol系列電泳槽。
2.2 準備1×電泳緩沖液：
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總體積
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1000
ml
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10×Tris-醋酸-SDS電泳緩沖液
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100 ml
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超純水
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900 ml
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2.2.1 外槽緩沖液：取適量體積1×電泳緩沖液用于外槽緩沖液。
2.2.2 內(nèi)槽緩沖液：對于還原樣品電泳，200 ml 1×電泳緩沖液中加0.5 ml 400×抗氧化劑，混合均勻后用于內(nèi)槽緩沖液。對于非還原樣品電泳，直接在內(nèi)槽中加入1×電泳緩沖液，不要添加400×抗氧化劑。
2.3準備上樣樣品：
注：表格以配制10 μl樣品為例，其他體積按照比例調(diào)整。
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總體積10 μl
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組份
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非還原樣品
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還原樣品
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蛋白樣品
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x μl
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x μl
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5×MonoClolor蛋白上樣緩沖液 (變性，非還原)
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2 μl
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2 μl
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20×樣品還原劑
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-
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0.5 μl
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超純水
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補至10 μl
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95℃ 10分鐘
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2.4電泳過程；
在電泳槽的內(nèi)槽內(nèi)加入1×電泳緩沖液(讓電泳緩沖液漫過加樣孔)，輕輕的撥出梳子，用1ml吸頭沖洗加樣孔3次；隨后在電泳槽外槽加入適量的1×電泳緩沖液。上樣，電泳。
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恒電壓
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起始電流
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結束電流
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電泳時間
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150V
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40-55 mA/板膠
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25-40 mA/板膠
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60+min
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注：冰浴電泳（可選）
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3. 染色：
3.1 將電泳后的PAGE膠取下放入塑料容器中，加入適量FastBlue蛋白染色液（以剛剛覆蓋過膠面為適），搖床常溫搖動，條帶5-10分鐘即可見（蛋白含量高于1
μg條帶）。
3.2 搖床常溫繼續(xù)搖動15-30分鐘至條帶清晰可見。
3.3 加入適量蒸餾水脫色，期間更換1-2次蒸餾水，搖床常溫搖動10-15分鐘至背景干凈。
3.4 觀察保存結果。
4. 轉膜：
4.1 轉印膜選擇：
Tris-醋酸凝膠轉膜可以使用NC膜和PVDF膜，需要選擇0.45 μm孔徑。PVDF膜使用前注意需要用甲醇潤濕活化。
4.2 10×Tris-醋酸轉膜緩沖液（溶液型）配制：
將10×Tris-醋酸轉膜緩沖液（濕轉，粉末型）粉末溶解于500 ml超純水中，即配成500 ml 10×Tris-醋酸轉膜緩沖液（溶液型），不要調(diào)節(jié)pH，pH~7.2。
4.3 準備1×轉膜緩沖液：
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1×即用型轉膜緩沖液 配制量 1升
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10×Tris-醋酸轉膜緩沖液(溶液型)
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100
ml
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變性蛋白
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非變性蛋白
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＜20 kD蛋白
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無水甲醇
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20%
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5-10%
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SDS
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0.01%
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0.01%
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20-80 kD蛋白
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無水甲醇
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10%
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0-5%
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SDS
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0.05%
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0.05%
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＞80 kD蛋白
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無水甲醇
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10%（NC膜）
0-5%（PVDF膜）
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0%
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SDS
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0.1%
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0.1%
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超純水
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定容至1升，不要調(diào)節(jié)pH，pH~7.2
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注：甲醇和SDS在轉膜中有拮抗作用。甲醇使蛋白更加結合在膜上，而SDS讓蛋白更加離開膜。因此對大蛋白轉膜來說，多加SDS，少加甲醇；而對小蛋白轉膜，多加甲醇，少加SDS。
4.4 轉膜條件：
以下轉膜條件僅供參考，客戶針對自己的目的蛋白，最好經(jīng)過1-2次預實驗后，確定最佳的轉膜條件。
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膜孔徑
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蛋白大小
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穩(wěn)流
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建議時間
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降溫措施
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0.22 μm
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低于20 kD
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200 mA
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~30分鐘
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不需要
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0.45 μm
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20-50 kD
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300 mA
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~45分鐘
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需要
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0.45 μm
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50-200 kD
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350 mA
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~50分鐘
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需要
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0.45 μm
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高于200
kD
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350 mA
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~2.5-4.5小時
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需要
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實驗示例：
