瓊脂糖凝膠電泳后的 DNA 條帶異常現(xiàn)象
你是否在 DNA 電泳后遇到過這種現(xiàn)象呢？
DNA Marker 或樣品的某些條帶呈笑臉型、W 型、亮度異常，多條條帶堆疊在一起、無法區(qū)分開，或者出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象
這些都會影響 Marker 的功能，使樣品的條帶大小和濃度難以準確預估
技術背景
核酸電泳是進行核酸研究的重要手段，是核酸探針、核酸擴增和序列分析等技術所不可或缺的組成部分。
溴化乙錠（EB）由于價格便宜，常用于瓊脂糖和 PAGE 凝膠中的核酸染色。但 EB 是強致癌誘變劑，由于其分子量較小，極易滲透細胞膜與胞內 DNA 分子嵌合，進而影響 DNA 的復制，破壞正常的遺傳生理現(xiàn)象。
鑒于此，很多廠家研發(fā)了大分子的新型核酸染料，新型核酸染料由于分子較大，更難進入細胞，所以安全性更高。而且靈敏度更高，比如 GelRed 大約是 EB 的 4～5 倍。
EB 與 GelRed 靈敏度對比
但也正是新型染料分子較大，會影響 DNA 分子在電泳時的遷移，所以 DNA 條帶在電泳中可能發(fā)生扭曲、變形、拖尾現(xiàn)象。
核酸染料結合 DNA 后改變了 DNA 的空間結構，使原本帶負電荷的電量減少，DNA 分子增大。
這一系列改變使得 DNA 分子在瓊脂糖凝膠電泳中的相互作用力改變，運動特點和未結合核酸染料的 DNA 分子也有所不同，這些因素共同導致 DNA 分子的形態(tài)在運動中發(fā)生了改變。特別是對大分子量的 Marker，可能導致 Marker 條帶變形、分不開的現(xiàn)象。
根據(jù)核酸染色和電泳的先后順序，核酸電泳一般可分為預染法（前染法）和泡染法（后染法）兩種方法, 在凝膠中添加染料稱為預染法，電泳完成之后再進行染色稱為泡染法。
我們實驗中經(jīng)常用到的就是預染法，但預染法在電泳中可能遇到上述的一些問題，而由于泡染法是電泳后再染色，可有效避免上述現(xiàn)象的產(chǎn)生。
實驗案例
下面，以我們東盛生物的新型核酸染料 DSRed（貨號：M7021）和 22 種 DNA Marker 為實驗材料，做一個預染法與泡染法中核酸染料對ＤＮＡ條帶形態(tài)影響的驗證：
我們選擇了不同大小的 Marker 并對其分類，分別用 1%、1.7%、3% 濃度的凝膠進行了預染法和泡染法電泳對比。
以下左圖為預染結果，右圖為泡染結果：
Figure.1 適合 1% 凝膠濃度的 DNA Marker（大片段較多）的預染/泡染對比（1）
Figure.2 適合 1% 凝膠濃度的 DNA Marker（大片段較多）的預染/泡染對比（2）
Figure.3 適合 1.7% 凝膠濃度的 DNA Marker（片段大小適中）的預染/泡染對比
Figure.4 適合 3% 凝膠濃度的 DNA Marker（小片段較多）的預染/泡染對比
結果分析：
從 fig.1 到 fig.4 的整體對比中可以清晰的看出，Marker 在預染膠中的條帶會發(fā)生彎曲成「W」型，且條帶大小越大，彎曲越明顯；而在泡染膠中，電泳時沒有染料的影響，條帶基本正常。
從 fig.1、fig.2 的兩種方法的對比中可以看出，在預染膠中，5kb 及以上的大分子 DNA 條帶更容易會出現(xiàn)變形、分不開的現(xiàn)象，而在泡染膠中 Marker 條帶是清晰分開的。
此外，DNA 的濃度也是需要考慮的因素，濃度越高，則結合的染料分子越多，遷移阻力也越大，同樣更容易出現(xiàn)條帶變形或分不開的問題。
總結
由于新型核酸染料會影響 DNA 分子在電泳時的遷移，特別是大分子的核酸，所以，如果在實驗中用到大分子量的 DNA Marker 或者用預染法電泳時 Marker 條帶出現(xiàn)彎曲、分不開的現(xiàn)象，建議使用泡染法進行染色。
此外，使用新型染料預染時一定要注意 Marker 及樣品用量。由于不同 Marker 的濃度不一樣，因此可以做幾個梯度進行加樣，選擇較合適的用量。也可以用 1X 上樣緩沖液對 Marker 進行不同倍數(shù)稀釋后使用，可以更有效地改善條帶異常的問題。不過只有使用后染法才能真正避免染料對核酸遷移的影響。
延伸問題：
Q1: 為什么同時電泳的樣品 DNA 條帶正常？
A: 因為樣品往往是單一條帶，或條帶數(shù)量比較少，沒有 Marker 那么多，那么就不容易產(chǎn)生條帶間的擠壓，所以看起來是比較正常的。但是大片段或高濃度片段會結合較多的染料，因此遷移速率依然會降低，所以也要注意樣品用量。必要時建議采用后染法進行染色。
Q2: 為什么上面的預染實驗結果沒有出現(xiàn)條帶劇烈變形、堆積、亮度很高的情況？
A: 因為嚴格按照使用建議添加了適量的染料，使其終濃度為 1X，而不是隨意添加一些使其過量，那樣非常容易加重 DNA 條帶異常的情況。
后染法真的很麻煩嗎？
后染并不麻煩，而且配制的染色液可以多次使用，缺點是比前染法稍微耗費染料、染色時間長（20~30 min）、靈敏度略低一些。
但是 5kb 及以上片段較多、濃度較高的 Marker 或樣品，如果前染的結果已經(jīng)如本文開頭那樣差了，那么建議還是用后染法得到一張清晰好看的電泳圖。
后染法與前染法效果對比
含有 5kb 及以上的 DNA 片段建議采用后染法
|